LSCM (Laser scanning confocal microscopy)
LSCM (Laser scanning confocal microscopy)
Tecnica che consente di acquisire immagini o analisi spettroscopiche con la massima risoluzione spaziale ottenibile da un sistema ottico a campo remoto. In questi sistemi le immagini vengono formate focalizzando un laser sul campione mediante un microscopio confocale e raccogliendo il segnale ottico in funzione della posizione del fuoco sul campione. La posizione del fuoco viene variata mediante una scansione del campione e l’immagine viene ricostruita punto per punto. L’idea che sta alla base della microscopia confocale è quella di focalizzare il segnale raccolto dall’obiettivo di un microscopio su di un filtro spaziale. Quest’ultimo è costituito da uno schermo opaco con un piccolo foro di dimensioni paragonabili a quelle dell’immagine di un oggetto di dimensioni pari alla risoluzione dell’obiettivo. La risoluzione spaziale di questo sistema composto è migliore di quella del singolo microscopio senza filtro spaziale ed è vicina al limite teorico di diffrazione. Il miglioramento è il risultato del fatto che sul rivelatore può arrivare solamente il segnale che si trova nell’immagine del foro del filtro spaziale. I vantaggi principali della microscopia confocale si trovano soprattutto nel miglioramento della risoluzione verticale, cioè nella direzione normale al piano focale. Per questo motivo applicazioni che richiedono la ricostruzione tridimensionale piano per piano di immagini di oggetti semitrasparenti, come per es., campioni biologici, fanno ampio uso di questa tecnica. Un altro miglioramento introdotto dal filtro spaziale è che la luce diffusa dal campione non desiderata viene bloccata prima di arrivare al rivelatore. In pratica il valore della risoluzione limite è confrontabile alla lunghezza d’onda del laser, che può essere selezionata a seconda dell’applicazione, ed è in genere compresa tra 100 nm e 1 μm. Altri fattori che influenzano la risoluzione sono il sistema di componenti ottici e la lunghezza d’onda della radiazione laser nel mezzo in cui si trova l’oggetto.